博士论文

(1)细菌RNA聚合酶不能识别真核生物的启动子。

(2)大部分真核基因都有内含子，这些内含子在转录后从前体mRNA上切除，形成成熟的mRNA。细菌细胞没有这种去除内含子的机制。

(3)一些真核生物的蛋白质是由前体分子加工的。例如，胰岛素被加工以去除前体分子内部的33个氨基酸残基，剩余的两个肽链分别形成胰岛素的A链和B链。

(4)真核生物产生的蛋白产物能被细菌蛋白酶识别和降解。

针对以上可能出现的问题，建议在克隆过程中采取以下措施:

①激素的编码序列应放在含有核糖体结合位点和起始密码子ATG的细菌强启动子附近(含有该序列的载体称为表达载体)。

②以激素mRNA为模板，通过逆转录酶可以合成激素基因。该DNA不含内含子，可以插入载体进行克隆。另外，如果蛋白质序列较短，可以通过化学合成获得基因。合成的基因应含有起始编码ATG，由激素蛋白的氨基酸序列推导出的编码序列，以及1~2个终止编码:

ATG———————————————TGA标签

现在，这个合成基因可以被插入到载体中。

③有时可在体外进行加工。如果加工困难，可以使用合成基因，从而省去加工过程。

④选择合适的突变宿主，防止蛋白水解。如果以酵母为宿主，上述很多问题都可以很容易解决，尤其是现在有了穿梭质粒载体，可以在大肠杆菌和酵母中同时复制。

描述:1)ATG、TAG和TGA是对应于mRNA中转录起始信号AUG和终止信号UAG和UGA的DNA序列。

2)用化学合成的方法克隆生长素释放抑制因子基因。生长索释放抑制剂是下丘脑分泌的一种激素，长14个氨基酸残基。因此，合成基因，包括在宿主细菌中表达所需的转录起始和终止信号，只有51bp长。