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多糖；、、、微生物；，，，药用；生物合成
摘要:活性多糖是新药研发的热点，其中微生物多糖的研究相对较多。近年来，对微生物多糖的研究有了进一步的发展。本文综述了药用微生物多糖在生物合成、作用机制和构效关系方面的最新研究进展。
关键词:多糖；微生物；药用；生物合成
微生物来源活性多糖的研究进展
近年来，活性多糖特别是微生物多糖的研究取得了许多进展，成为新药研发的热点。本文将重点介绍近年来有关药用微生物多糖的生物活性、作用机制和构效关系的研究。
关键词多糖；微生物；吸毒；生物活动
多糖广泛分布于高等植物、地衣、海藻、动物和微生物中。微生物多糖是目前研究得比较详细的一类多糖。其广泛的生物活性使其成为微生物药物的重要组成部分，在新药研发中受到越来越多的关注。本文综述了迄今为止发现的微生物多糖的药用生物活性，总结了近年来多糖的构效关系和作用机制的研究成果。
1的免疫调节功能
免疫调节剂在疾病治疗中的作用越来越受到重视。多糖免疫调节剂最早发现于40多年前。在过去的二十年中，越来越多的微生物多糖被证实对免疫反应的调节具有重要意义。这些多糖的免疫调节作用涉及到免疫系统的各个方面，对其免疫调节机制的研究也体现在各个层面。这些多糖的结构特征决定了它们与宿主免疫系统的相互作用，也已被深入研究。下面介绍几种典型的免疫调节剂。
两性多糖(ZPS)是一类同时具有阳离子和阴离子结构以实现其生物学功能的多糖。多糖A(PS A)是Zps的分类原型。PS A是从革兰氏阴性厌氧菌脆弱拟杆菌中分离的两种荚膜多糖之一。Zps在细胞表面组装成荚膜多糖复合体(CPC)。早期研究证明CPC可以调节腹腔内脓毒症相关脓肿的形成[1]。腹腔注射CPC可诱导脓肿形成，而皮下和肌肉预防性给药可防止宿主在细菌感染后形成脓肿。一方面，Zps在诱导脓肿形成的过程中发挥多重作用，可以诱导细菌粘附于腹腔间皮表面，刺激一些免疫促进细胞因子和趋化因子，进而诱导宿主细胞表达CAMs，从而完成腹腔内多形核白细胞的募集。另一方面，Zps在防止脓肿形成和保护机体免于免疫反应中的作用不是作为经典的免疫原来介导特异性免疫反应，而是调节宿主的免疫系统，从而完全抑制导致脓肿形成的免疫反应。其具体机制是Zps对CD4+T细胞活性和IL-2产生的调节[2]，IL-2似乎是Zps调节免疫预防脓肿的中心环节[3]。对其构效关系的研究表明，含有正负电荷基团的Zps重复单元是其免疫调节的关键结构，破坏多糖的电荷结构可显著降低其活性[4]。
从酵母和真菌中纯化的1.2 β(13)葡聚糖是另一种免疫调节剂。基于β(16)葡聚糖的分支随机分布在β(13)葡聚糖的主链上。Williams等人证明β(13)葡聚糖能显著提高动物体内中性粒细胞水平，增加骨髓细胞增殖。PGG是一种高度纯化的专利β(13)葡聚糖，来自Williams的研究小组。PGG给药后，中性粒细胞和嗜酸性粒细胞比例增加，小鼠体外获得的中性粒细胞吞噬功能增强[5]；巨噬细胞的形态发生了变化，巨噬细胞在脂多糖(LPS)的刺激下表现出磷酸酶活性增加和NO产生的特征[6]。研究表明，β(13)葡聚糖可以调节淋巴细胞和单核细胞中促免疫细胞因子的产生[7]。β(13)葡聚糖对NFκB样和NFIL6样转录因子的调节作用具有时间和浓度依赖性[8]。涉及的信号转导途径与超抗原LPS不同。PGG在预防治疗方面也取得了积极的实验结果。能显著降低腹腔脓毒症的死亡率。Williams在脓毒症小鼠模型试验中研究了β(13)葡聚糖对转录激活和细胞因子表达的影响。发现与对照组动物相比，NFκB和NFIL6的核结合活性降低，TNFα和IL6的mRNA水平也降低。转录因子活性和细胞因子表达的下调与脓毒症动物存活率的提高呈正相关[10]。β(13)葡聚糖的免疫调节生物活性基于其与巨噬细胞和多形核嗜中性粒细胞(PMN)的直接相互作用。Muller等人的工作表明，磷酸葡聚糖，一种水溶性(13)βD葡聚糖，可以与人或小鼠单核细胞/巨噬细胞结合。这种结合特别导致外来细菌的内化和细胞质空泡化的增加[11]。β(13)葡聚糖的免疫调节也涉及补体途径。补体受体3(CR3)也被确定为某些葡聚糖的受体[12]。CR3介导的吞噬作用和脱粒作用需要CR3结构域上的iC3b结合位点和葡聚糖结合位点同时与配体结合。用抗PGG葡聚糖受体的单克隆抗体处理中性粒细胞可以抑制NFκB样因子的激活[13]。煮沸酵母菌株和酶处理获得可溶性和不溶性葡聚糖粗品。不溶性葡聚糖可以通过磷酸化、硫酸化和胺化进行衍生化，以提高其溶解性。可溶性葡聚糖在水溶液中主要以线性三螺旋结构存在。研究表明，糖链的螺旋构象是其生物活性的必要条件，糖链中的亲水基团(多羟基)应位于螺旋体表面[14]。来自微酵母的葡聚糖的免疫调节活性还受到其分子量和β(16)糖苷键数量的影响。其他β(13)D葡聚糖也是如此，比如真菌多糖pestalotan。此外，支链的长度也会影响多糖的活性。从真菌疫霉中分离出的活性β(13)D葡聚糖，其成分具有葡萄糖三糖的支链，其活性远高于葡萄糖二糖的支链[16]。
1.3甘露聚糖从白色念珠菌中分离得到具有一定免疫调节活性的甘露聚糖。由巨噬细胞呈递的甘露糖结合凝集素(MBL)可以结合甘露聚糖，并通过非自我识别机制激活宿主免疫系统。甘露聚糖包裹感染性抗原，并介导细胞内吞和吞噬作用。甘露聚糖受体识别多糖中的重复单位，导致细胞信号转导、细胞因子产生和补体激活。研究表明，白色念珠菌甘露聚糖皮下注射后对宿主的免疫抑制作用与给药后对迟发型超敏反应的抑制作用有关[17]。IL-4是介导甘露聚糖特异性免疫下调的关键细胞因子。此外，有研究表明，IL12p40、IL10和IFNγ对CD+T细胞(下调效应细胞)的产生也有一定的影响[18]。
蛋白结合多糖PSK和PSP分离自真菌蘑菇。这些化合物结构相似，分子量约为100 kDa [19]。单糖由α(14)和β(13)糖苷键连接，蛋白质部分主要是天冬氨酸和谷氨酸，蛋白质含量约为15%。这些多糖在体外能抑制肿瘤细胞系的生长，在体内具有抗肿瘤活性。对食道癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌有一定的防治作用。这些多糖的免疫调节机制尚不清楚。研究表明，PSK可以结合并抑制PSK给药后小鼠的免疫抑制细胞因子TGF β [20]。PSK还可以激活中性粒细胞，这可能是其抗癌活性的部分原因。PSK和PSP是生物反应调节剂，能刺激T细胞活化，诱导产生IFNγ和IL2。还发现PSK和PSP能增强小鼠体内超氧化物歧化酶的活性[21]。
1.5透明质酸透明质酸(HA)可由链球菌产生，也是构成哺乳动物组织细胞外基质的主要碳水化合物成分，存在于皮肤、关节、眼睛等大多数器官和组织中。透明质酸是二糖的重复。这种二糖是最简单的阴离子氨基葡萄糖。透明质酸通过与真核细胞中的CD44受体结合来调节免疫系统。配体受体之间的这种相互作用对于调节T细胞细胞间通讯和白细胞外渗非常重要[22]。低分子量HA可用于阻断T淋巴细胞CD44和真核HA之间的相互作用。这在临床上可用于预防同种异体移植物的排斥反应，以保护机体器官的功能。此外，HA可促进伤口愈合，可在眼和关节手术中作为人HA的替代品[9]。
2抗肿瘤活性微生物
多糖的抗肿瘤活性与其免疫调节功能密切相关。多糖能激活免疫细胞，诱导多种免疫细胞因子和细胞因子受体基因的表达，增强机体抗肿瘤免疫力。从担子菌中获得的抗肿瘤多糖如香菇多糖、裂褶多糖、云芝多糖、茯苓多糖等在国内外已广泛应用于临床，且均具有上述免疫调节剂的特征结构。从香菇子实体和深层发酵菌丝体中获得了两种具有抗肿瘤活性的多糖，即含有少量多肽的β(13)葡聚糖和α甘露糖。云芝多糖PSK具有蛋白结合多糖的结构。裂褶多糖和茯苓多糖也是β(13)葡聚糖，但茯苓多糖在含有β(16)葡聚糖侧链时没有活性，但通过高碘酸盐氧化反应去除侧链后，表现出显著的抗肿瘤活性。免疫调节多糖的抗肿瘤作用需要宿主免疫系统的参与，但一些微生物多糖在体外也表现出对肿瘤细胞生长的抑制作用。除了免疫调节作用，近年来还研究了多糖抗肿瘤活性的其他机制。主要有以下几个方面[23]: (1)影响细胞的生化代谢:茯苓多糖可抑制肉瘤S180细胞的增殖，可导致S180细胞膜唾液酸(SA)含量增加，而膜磷脂、花生四烯酸、肉豆蔻酸含量减少，显著抑制细胞膜PI转化，影响肿瘤细胞的转移。香菇、猪苓、茯苓多糖能抑制人早幼粒细胞白血病HL60细胞中酪氨酸蛋白激酶(TPK)的活性，激活磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶(PTPP)，从而降低酪氨酸蛋白的磷酸化程度。(2)对细胞周期的影响:某些多糖可能影响肿瘤细胞的细胞周期。Kamei等人将云芝多糖与结肠癌细胞AGS一起培养4天，肿瘤细胞的数量与对照组相比明显减少。流式细胞仪显示肿瘤细胞生长阻滞于S期和G2/M期[15]。(3)抗氧化作用:体内过量的超氧自由基和脂质过氧化物(LPO)继续损伤DNA，会导致细胞癌变。动物和临床实验表明，PSK能提高超氧化物歧化酶(SOD)的活性，减轻肿瘤宿主的氧化应激。Kariya等观察到云芝多糖在肼氧化反应体系中具有自由基清除剂的功能，通过电子自旋振动检测证明其具有类SOD的功能。也有报道云芝多糖能增强正常小鼠和正常迟发型超敏反应(DH)小鼠淋巴细胞、脾脏和胸腺中SOD的活性，但对肿瘤组织中SOD有明显的抑制作用。(4)其他:香菇、云芝、灵芝等多糖能抑制大鼠肝细胞对致癌物苯并芘的吸收。香菇多糖可使肿瘤部位血管扩张出血，导致肿瘤组织坏死。一些来自微生物的多糖类似于肿瘤细胞表面的糖分子，可以抑制肿瘤细胞的粘附，从而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移[24]。
3抗病毒活性
多糖的抗病毒作用在医药领域引起了极大的关注。特别是在抗HIV方面，硫酸多糖因其明确的活性成为近年来的研究热点[26]。研究表明，其作用机制不仅是多糖的免疫激活作用，而且这类聚合物可以通过阻断HIV病毒gp120与宿主细胞CD4受体的结合而发挥作用，从而阻断病毒对宿主细胞的吸附，阻止合胞体细胞的形成[25]。一些硫酸化多糖还能抑制HIV逆转录酶的活性，硫酸化侧链与RNA模板引物上的一些酶有相同的结合位点，从而产生竞争性抑制。最近的研究还发现，硫酸化多糖与HIV1反式激活剂tat结合，可以阻止tat蛋白进入细胞，抑制HIVLTR的转录激活，从而抑制HIV1的复制和整合。硫酸化多糖的抗病毒活性首先来源于其聚阴离子性质，因此硫酸基团是这些多糖活性的必要条件。分子中硫酸基团含量越高，其抗HIV作用越强。但过多的硫酸盐会产生抗凝等不良反应[27]。硫酸基团分布的空间构象也影响抗病毒活性。例如，Tat蛋白与肝素的结合至少需要2O、6O和N位的硫酸化[28]。糖链柔性的降低可以提高硫酸多糖的抗病毒活性。分子大小是影响多糖抗病毒活性的另一个因素。硫酸葡聚糖的抗HIV活性随着相对分子质量的增加而增加，在1× 104 ~ 5× 105范围内可保持最大活性。除了抗艾滋病毒，多糖还可以抑制其他类型的病毒，如单纯疱疹病毒(HSV1，HSV2)，巨细胞病毒(CMV)，流感病毒(流感病毒)和水泡性胃炎病毒(VSV) [29]。香菇多糖具有抗肿瘤作用，硫酸化后具有明显的抗艾滋病作用。在100mg/L的浓度下可完全抑制RT活性，在10 ~ 100 mg/L的浓度下可抑制合胞体细胞的形成，在10mg/L的浓度下可强烈抑制HIV抗原的合成，保护被HIV感染的MT4细胞。但硫酸化多糖失去了原有的抗肿瘤活性。推测硫酸化多糖和非硫酸化多糖的免疫调节机制不同。经13CNMR、苯胺蓝荧光法和粘度法证明，硫酸基团的引入改变了多糖的理化性质和空间构象，是多糖活性的决定因素。
4其他活动
多糖的免疫调节功能使其在临床上具有抗感染和抗炎活性。与常规药物治疗相比，使用免疫调节剂有其独特的优势。增强宿主免疫系统的先天抗感染能力可能会有效解决抗生素耐药性问题。Janice等人建立了以重组SIL 1R1为靶点的抑制剂筛选模型，从链霉菌的代谢产物中获得了拮抗剂IL 139A。动物模型研究表明，它们具有抗类风湿性关节炎的作用[30]。139A生物合成中糖基转移酶基因的克隆和鉴定也已完成[31]。中药植物多糖的降血糖活性被广泛研究。近年来，从微生物中也发现了一些具有明显降血糖作用的多糖。冬虫夏草多糖CSF10能增强葡萄糖激酶活性，加速葡萄糖代谢。还可以降低GLUT2蛋白的水平，从而抑制肝脏葡萄糖的输出，最终达到降血糖的目的[32]。此外，还发现一些微生物多糖(如银耳多糖)和一些多糖硫酸化衍生物具有肝素样抗凝血作用，其抗凝血活性与多糖的分子量和硫酸化程度有关。黑木耳多糖和银耳多糖能抑制血栓的形成，这可能与其能降低血栓纤维蛋白原含量、血小板数量及其粘附性有关。香菇多糖能促进胆固醇代谢，降低血清胆固醇含量，从而达到降血脂的目的；灵芝多糖能抑制人中性粒细胞自发性和Fas介导的凋亡，与抗衰老活性有关；灵芝中的一种小多糖可以增加蛋白质和核酸的合成。然而，一些微生物多糖可以抑制RNA酶，减少RNA降解，在RNA治疗中发挥协同作用。5结论
多糖药物具有多效、低毒、来源广泛、天然绿色等优点。多糖与现有药物联用，可以提高药物的作用范围和有效性，减少用药剂量，防止或延缓耐药性的产生。但由于多糖的结构过于复杂，其质量标准难以控制，结构的确定和合成也比较困难。缺乏明确的机制研究；但有些多糖在天然产物中含量较低，不易分离。这限制了它们的临床应用。近年来，随着结构分析技术的进步和机理研究的不断积累和深入，人们对多糖如何作用于细胞因子网络和协调生物功能的结构特征有了更多的了解，并发现了一些多糖的特异性受体，为开发新的活性化合物提供了基础。对多糖构效关系的认识也更加丰富，提高活性的结构改造工作也取得了很大进展。多糖的结构研究是多糖研究中亟待解决的薄弱环节。在保证多糖纯度的前提下，结合现有的二维核磁技术(如COSY谱、NOESY谱、HOHAHA谱、TOCSY谱等。)使我们有可能推断一些多糖的完整一级结构[33]。质谱由于其高灵敏度，在多糖的结构分析中也发挥了越来越重要的作用，尤其是极微量的多糖。FABMS和液质联用技术在多糖结构分析中的应用越来越广泛。多糖的高级结构分析也发展起来了，但还不能像核酸和蛋白质的结构测定那样自动化、小型化、标准化。药用微生物多糖的生物合成研究也逐渐开展起来。对这些微生物菌株的多糖合成基因的分析发现，它们具有相同的操纵子结构，提示这些多糖的生物合成具有相同的分子机制。对多糖合成基因簇及其生物合成途径的深入了解，可以为进一步的组合生物学研究提供理论基础，最终获得新的结构多糖，改变天然多糖的理化性质，提高多糖的活性和产量。
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