如何设计引物？

3.在框的底部可以设置许多限制，例如片段长度、必须包含的片段的位置、引物长度、引物退火温度等。您可以设置它们。

4.点击“pickup primers”就会出现下一页，里面会列出各种各样的设计。一般来说，第一对引物最合适。

同时，在设计引物和选择靶DNA序列区域时，可以遵循以下原则:

(1)引物的长度约为16-30bp。如果太短，会降低退火温度，影响引物与模板的配对，从而增加非特异性。如果太长了，就浪费了，也很难合成。

(2)引物中G+C的含量通常为40%-60%，引物的解链温度TM大致可以估算为:4 (G+C)+2 (A+T)。

(3)四个碱基要随机分布，3’端不能有三个连续的G或C，容易导致假起始。

(4)引物的3’端应优选对应于靶序列阅读框中密码子的第一或第二个核苷酸，以减少密码子摆动引起的错配。

(5)引物中不应有二级结构，尤其是3’端。

两条引物不能互补，特别是3’端，防止引物二聚化，降低产量。两个引物之间最好没有四个连续碱基的同源性或互补性。

(7)引物的5’端对扩增特异性的影响很小。可以在引物设计中加入限制性酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点和标记物，如生物素、荧光素和地高辛。一般来说，除了5’端的限制性酶切位点外，还要加上1-2个保护碱基。

引物与模板结合位点以外的序列不互补，扩增产物本身没有稳定的二级结构，避免非特异性扩增，影响产量。

(9)简并性引物应使用简并性低的密码子，如Met，3只有一个密码子，3’端不应有简并性。否则，由于产量低，可能看不到扩增产物。