高中生物选修课3复习内容。

1.1 DNA重组技术的基本工具

1.为什么细菌中的限制性内切酶不会切割细菌的DNA？

提示:到目前为止，基因工程中使用的限制性内切酶大多是从细菌或霉菌中提取的，它们中的每一种都能识别并切断DNA上特定的碱基序列。细菌中的限制性内切酶之所以不切断自身的DNA，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以降解外源入侵的DNA。在生物的长期进化中，含有某种限制性内切酶的细胞的DNA分子，要么没有这种限制性内切酶的识别和切割序列，要么甲基被甲基化酶转移到识别序列的碱基上，使限制性内切酶无法切割。这样，细菌虽然含有一些限制酶，但自身的DNA不会被切断，还能防止外来DNA的入侵。

2.天然DNA分子可以直接作为基因工程载体吗？为什么？

提出基因工程中用作载体的许多DNA分子是质粒，即一种独立于细菌假核DNA的自我复制的双链闭环裸DNA分子。任何质粒都可以作为基因工程的载体吗？其实并不是。作为基因工程的载体，必须满足以下条件。

(1)载体DNA必须具有一个或多个限制性酶切位点，以便将目的基因插入载体。用于插入靶基因的这些限制性酶的位置也必须在质粒本身所需的基因片段之外，以便不会因插入靶基因而失活。

(2)载体DNA必须具有自我复制的能力，或者整合到受体染色体DNA中，与染色体DNA的复制同步复制。

(3)载体DNA必须携带标记基因，以便重组后筛选重组体。

(4)载体DNA必须是安全的，对受体细胞无害，或者不能进入受体细胞以外的其他生物细胞。

(5)载体DNA的分子大小要适合提取和体外操作，过大不便于操作。

实际上，天然存在的质粒DNA分子并不完全满足上述条件，必须经过人工改造才能用于基因工程操作。

3.DNA连接酶有连接单链DNA的能力吗？

提示:到目前为止，发现的DNA连接酶都没有连接单链DNA的能力。至于原因，目前还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。

4.根据你的知识，能否分析一下原核生物中限制酶存在的功能？

提出原核生物在自然界中容易受到外来DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，防止外来病原体的入侵。限制酶是细菌的防御工具。当外来DNA入侵时，它会被用来切断外来DNA，以保证自身的安全。所以原核生物中的限制性内切酶主要是切割外源DNA，使其失效，从而保护自己。

5.DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？

不是一回事。基因工程中使用的连接酶有两种:一种是从大肠杆菌中分离出来的，叫做E？大肠杆菌连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离的，称为T4连接酶。这两种连接酶的催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，而不是单链DNA。DNA连接酶和DNA聚合酶都形成磷酸二酯键，那么两者的主要区别是什么？

(1)DNA聚合酶只能在已有核酸片段的3’端羟基上添加单个核苷酸，形成磷酸二酯键；然而，DNA连接酶在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，而不是在单个核苷酸和DNA片段之间。(2)DNA聚合酶以DNA链为模板，从单个核苷酸通过磷酸二酯键形成与模板链互补的DNA链；DNA连接酶同时连接DNA双链中的两个缺口。所以DNA连接酶不需要模板。另外，虽然都是由蛋白质组成的酶，但组成成分和性质不同。

6.充当「分子运输工具」的条件是什么？

提示:它能自我复制，有一个或多个切割位点，有标记的基因位点，对受体细胞无害。

7.(1)限制酶识别的序列有什么特征？

限制性内切酶识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都能找到一个中轴，中轴两侧的双链DNA上的碱基对称重复排列。

(2)限制性内切酶能切割DNA的任何部分吗？

任何一种限制性内切酶都只识别和切断特定的核苷酸序列，这是由限制性内切酶的性质决定的。

(3)DNA连接酶在哪里连接？

DNA连接酶将一个DNA片段3’端的羟基与另一个DNA片段5’端的羟基连接起来形成酯键，而不是连接互补碱基之间的氢键。

1.2基因工程的基本操作程序

1.作为基因工程表达载体，仅仅包含目的基因就能完成任务吗？为什么？

答:不能，因为目的基因在表达载体中表达并发挥作用，还需要其他控制元件，如启动子、终止子、标记基因等。构建上述元素的主要原因是:(1)对于生物之间的基因交流，只有受体生物自身基因的启动子才能更有利于基因表达；(cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只需将编码序列导入受体生物就不能转录；(3)目的基因是否导入受体生物需要筛选标记；(4)为了增强目的基因的表达水平，常常加入一些其他的调控元件，如增强子；(5)有时需要确定目标基因表达的产物存在于细胞的什么地方，往往需要添加一个可以标记存在部分的基因(或者制作一个目标基因和标记基因的融合基因)，比如绿色荧光蛋白基因。

2.根据农杆菌能将目的基因导入双子叶植物的机理，能否分析一下农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因？如果你想把一个抗病基因导入单子叶植物，比如小麦，理论上应该怎么做？

提出根癌农杆菌可分为根癌农杆菌和发根农杆菌，植物基因工程中以Ti质粒介导的根癌农杆菌遗传转化最多。根癌农杆菌广泛存在于双子叶植物中，裸子植物对其也很敏感。当这些植物被这种真菌感染后，就会诱发肿瘤。根癌农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质来吸引根癌农杆菌到受伤组织。研究证明，这些物质主要在双子叶植物的细胞壁中合成，而在单子叶植物中通常不存在，这也是单子叶植物不易被根癌农杆菌侵染的原因。当单子叶植物被农杆菌感染进行遗传转化时，需要添加上述酚类物质。同时，农杆菌感染对不同单子叶植物的遗传转化效果也有很大差异。如果想把一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点:①选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都能侵染单子叶植物；②为了使农杆菌靠近植物组织的受伤部位(趋化性)，激活农杆菌Vir区的基因，使T-DNA转移并插入染色体DNA，应加入趋化性和诱导性物质。

3.大肠杆菌可以生产人胰岛素。考虑到之前关于细胞器功能的知识，以及基因工程操作程序的基本思路，想一想。如果要生产人糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？

提出某些蛋白肽具有* * *价的糖链，在真核细胞中存在的内质网和高尔基复合体上加工，而这两种细胞器在大肠杆菌中并不存在，因此，在大肠杆菌中不可能产生这种糖蛋白。

4.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成部分。当其成分异常时，动物可能会患一些疾病，如镰状细胞性贫血。如果通过基因工程让大肠杆菌产生小鼠β-珠蛋白，你想想怎么设计。

提示:基本操作如下:

(1)从小鼠中克隆了β-珠蛋白基因的编码序列(cDNA)。

(2)将cDNA与适用于大肠杆菌的启动子预嫁接，并加入四环素抗性基因以构建表达载体。

(3)将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体不进入大肠杆菌，大肠杆菌会因为不含四环素抗性基因而死亡；如果大肠杆菌菌落在培养基上生长，表明β-珠蛋白基因已经进入其中。

(4)培养带有β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集细菌，破碎后从中提取β-珠蛋白。

5.你能猜出从mRNA到cDNA的逆转录过程大致分为哪些步骤吗？

逆转录酶可以使用DNA和RNA作为模板来合成互补的DNA链。和其他DNA聚合酶一样，逆转录酶也是以5’→3’的方向合成DNA(图1-3)。

cDNA合成的过程如下:第一步，逆转录酶以RNA为模板，合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使其变成单链DNA。第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。

6.6的放大过程是怎样的。PCR？

PCR扩增是获得目的基因的非常有用的方法，也是分子鉴定和检测的非常灵敏的方法。PCR的扩增反应过程包括以下主要过程。

第一步:加热反应体系(包括双链模板、引物、耐高温DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸、酶促反应所需的离子等。)到90 ~ 95℃，使双链DNA模板的两条链之间的氢键得以打开，成为单链DNA作为互补链聚合的模板。

第二步:将反应体系冷却至55 ~ 60℃，使两条引物与模板DNA链3’端的互补序列互补，称为复性。

第三步:将反应体系温度升至70 ~ 75℃，在耐高温DNA聚合酶的催化下，在引物提供的3-OH上添加一个与模板互补的单核苷酸，使DNA链延长，生成一个与模板链互补的DNA链。

以上三步完成后，一个DNA分子变成两个DNA分子，随着重复次数的增加，DNA分子以2n的形式增加。PCR的反应过程是在PCR扩增仪中完成的。

7.分子杂交技术的显示带是什么？

分子杂交是基因工程中常用的技术，主要用于检测和鉴定。可分为核酸分子间的杂交和蛋白质分子间的杂交。常用的技术有:

DNA和DNA分子之间的杂交。目的基因是否整合到受体生物的染色体DNA中，是目的基因在真核生物中稳定存在和遗传的关键。如何证明这一点，需要南方杂交技术。基本方法如下:第一步，提取受体生物DNA，适当酶切后，琼脂糖凝胶电泳分离出大小不同的片段；其次，将凝胶上的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上；第三，用放射性同位素(或生物素)标记的目的DNA片段作为探针，与硝酸纤维素膜上的DNA杂交；第四步，将x光底片压在硝酸纤维素膜上，使底片在黑暗中感光；第五步，冲洗x光底片。如果底片上有黑色条带，说明受体植物的染色体DNA上有目的基因。

DNA和RNA分子之间的杂交。它是一种检测目的基因是否转录mRNA的方法，与Southern杂交相同，只是第一步是从受体植株中提取mRNA而不是DNA，杂交条带的出现与Southern杂交相同。

蛋白质分子间的杂交(抗原-抗体)。是检测目的基因是否表达蛋白质的方法。

1.3基因工程的应用

1.表1-1转基因生物与目标基因之间的关系

转基因生物的目的基因从哪里来？

苏云金杆菌、抗虫棉Bt毒素蛋白基因

烟草抗纹枯病几丁质酶基因和抗毒素合成基因

耐盐碱和抗旱作物中调节细胞渗透压的基因

耐寒番茄抗冻蛋白基因鱼

抗除草剂大豆抗除草剂基因

加糖的水果可以减少奶牛体内的乳糖。

甜味基因肠乳糖酶基因

生产胰岛素-人胰岛素基因人的工程菌

2.利用微生物生产药物有什么优势？

所谓利用微生物生产蛋白质药物，是指将人需要的某种蛋白质编码基因构建成表达载体，然后将其导入微生物，再利用微生物发酵生产蛋白质药物。与传统药学相比，具有以下优势:(1)以活细胞为表达系统，表达效率高，无需大型设备和大型工厂即可大量生产药物。(2)可以解决传统制药原料来源不足的问题。例如，胰岛素是治疗糖尿病患者的药物，一个糖尿病患者每年需要的胰岛素只能从40头牛或50头猪的胰腺中提取。1978年，科学家从2 000 L大肠杆菌发酵液中获得100 g胰岛素，相当于从1 000 kg猪胰腺中提取的量。再比如，生长素是治疗侏儒症的药。治疗一个侏儒症患者，每年需要从80具尸体的脑垂体中提取生长素。利用基因工程菌进行发酵生产，不需要从动物或人体中获取原料。(3)降低生产成本，减少生产人员和管理人员。

1.4蛋白质项目的兴起

1.蛋白质工程操作程序的基本思路和基因工程有什么区别？

答:基因工程遵循中心原理，从DNA→mRNA→蛋白质→折叠产生功能，基本上产生了自然界已经存在的蛋白质。蛋白质计划按照以下思路进行:确定蛋白质的功能→蛋白质应该具有的高级结构→蛋白质应该具有的折叠状态→应该具有的氨基酸序列→应该具有的碱基排列，从而创造出自然界不存在的蛋白质。

2.你了解酶工程吗？大多数酶来自蛋白质。酶工程和蛋白质工程有什么区别？

提示:酶工程是指通过工程手段将酶的生物催化作用应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护的一门科学技术。一般来说，酶工程包括两个方面:酶制剂的生产和应用。酶工程的应用主要集中在食品工业、轻工业和医药工业。α-淀粉酶、糖化酶和葡萄糖异构酶能持续作用于淀粉，从而产生高果糖浆代替蔗糖。蛋白酶用于皮革脱毛胶和洗涤剂工业；固定化酶还可以治疗先天性酶缺乏或器官缺陷引起的某些功能衰竭。至于我们日常生活中看到的加酶洗衣粉、嫩肉粉，就是酶工程最直接的体现。所谓酶工程，就是用工程菌生产酶制剂，没有根据酶的功能设计酶的分子结构，然后根据酶的分子结构确定相应基因的碱基序列的步骤。因此，酶工程的重点在于合理充分利用现有的酶，而蛋白质工程的重点在于改造现有的蛋白质分子。当然，随着蛋白质工程的发展，其成果也将应用于酶工程，使酶工程成为蛋白质工程的一部分。

3.天然蛋白质的转化应该通过直接操纵蛋白质分子来实现，还是通过操纵基因来实现？

毫无疑问，天然蛋白质的转化应该是通过操纵基因来实现的。主要原因如下:(1)任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，也就是说蛋白质是经过转化的，转化的蛋白质是可以传递下去的。如果直接转化蛋白质，即使转化成功，转化的蛋白质分子也不能遗传。(2)改造基因比直接在蛋白质中改造更容易，难度更小。

4.动物乳腺生物反应器？

65438-0987年，美国科学家戈登等人首次在小鼠乳汁中生产出一种医用蛋白质——TPA(组织型纤溶酶原激活剂)，论证了从动物乳腺中生产高附加值产品的可能性。利用动物乳腺生产高价值产品的方式称为动物乳腺反应器。

为什么要用动物乳腺作为反应器来生产高价值的蛋白产品？这是因为动物乳腺是一个高度分化的特化腺体，合成蛋白质的能力非常强，特别是对于一些经过长期遗传改良，专门产奶的乳用动物品种。合成蛋白质的能力更是惊人。一头优质奶牛一年能产10 000公斤牛奶。甚至一只奶山羊一年也能产2 000公斤奶。动物乳腺生物反应器具有四大优势:①产量高，易于收获目标产物，可随乳汁分泌排出动物体外；②目标产品质量良好。动物乳腺组织不仅具有按照遗传信息的流向合成蛋白质的能力，还具有一整套修饰和加工蛋白质的能力，如糖基化、羧基化、磷酸化和分子组装等。，而微生物和植物系统都不具备这种全面的蛋白质后加工能力；③产品成本低；④从奶牛身上提取产品相对简单。