pcr核酸的真实问题
PCR的常见问题:
PCR产物的电泳检测时间一般小于48小时，有的比当天电泳检测要好。超过48小时后，条带不规则甚至消失。
假阴性
没有扩增带出现。
PCR反应的关键环节是①模板核酸的制备，②引物的质量和特异性，③酶的质量和溴化乙锭的使用，④PCR循环条件。要找到原因，也要对以上环节进行分析研究。
模板:①模板中含有蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中的蛋白质未被消化去除，尤其是染色体中的组蛋白，④模板在提取制备时丢失过多，或吸入苯酚。⑤模板核酸没有完全变性。当酶和引物的质量良好时，没有扩增带，这很可能是由于样品的消化和模板核酸提取过程的失败。所以为了配制有效稳定的消化液，程序要固定，不能随意更改。
否定的；消极的；负面的；负的
需要注意的是，Taq酶或溴化乙锭有时会被遗忘。
引物:引物的质量、引物的浓度、两个引物的浓度是否对称是PCR失败或扩增带不理想的常见原因，容易分散。部分批次的引物合成质量存在问题。两个引物中的一个浓度高，另一个浓度低，导致不对称扩增效率低。对策有:①选择好的引物合成单元。②引物的浓度不仅取决于OD值，还取决于引物原液的琼脂糖凝胶电泳。一定要有引物带，两条引物带的亮度要大致相同。比如一个引物有带，另一个引物没有带，此时PCR可能会失败，要和引物合成单位协商解决。如果一种底漆亮度高，另一种亮度低，稀释底漆时浓度要平衡。(3)引物应高浓度小包装保存，避免引物因反复冻融或长期存放在冰箱中而变质降解。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体。
Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCR扩增效率有很大影响。浓度过高会降低PCR扩增的特异性，浓度过低则会影响PCR扩增的产量，甚至使PCR扩增失败而不产生扩增带。
反应体积的变化:通常，用于PCR扩增的体积为20ul、30ul和50ul。或者100ul，PCR扩增要用哪个体积是根据科研和临床检测的不同目的来设定的。做小体积的时候，比如20ul，一定要设置好模式条件，否则很容易失败。
物理原因:变性对PCR扩增非常重要，如变性温度低、变性时间短，极易产生假阴性；过低的退火温度会导致非特异性扩增，降低特异性扩增效率。过高的退火温度会影响引物和模板的结合，降低PCR扩增效率。有时需要用标准的温度计来检测扩增器或水溶锅中的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
靶序列的变异:如果靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板的特异性结合，或者由于靶序列的某一段缺失导致引物与模板失去互补序列，其PCR扩增就不会成功。
假阳性
PCR扩增条带与靶序列条带一致，有时条带更整齐、更亮。
引物设计不当:选择的扩增序列与非靶扩增序列具有同源性，因此在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物是非靶序列。如果靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。引物需要重新设计。
靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两个原因:一是全基因组或大片段的交叉污染导致假阳性。这种假阳性可以通过以下方法解决:操作要小心轻柔，防止靶序列被吸入装填枪或溅出离心管。除酶和不能耐高温的物质外，所有试剂或设备都要高压灭菌。使用的离心管和进样枪头应一次性使用。必要时，在添加样品之前，用紫外线照射反应管和试剂以破坏存在的核酸。二是空气中核酸小片段的污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。它们可以相互拼接，与引物互补后，PCR产物可以扩增，产生假阳性，通过巢式PCR可以减轻或消除。
出现非特异性扩增带
PCR扩增后的条带与预期大小不一致，或大或小，或特异性扩增条带和非特异性扩增条带同时出现。出现非特异性条带的原因有两个:一是引物与靶序列不完全互补，或者引物聚合形成二聚体。第二，Mg2+离子浓度过高和退火温度过低与PCR循环次数过多有关。其次是酶的质量和数量，往往某些来源的某些酶容易出现非特异性条带而另一些则不会，有时酶量过高会出现非特异性扩增。对策如下:必要时重新设计指南。减少酶的用量或从其他来源更换酶。减少引物的用量，适当增加模板的用量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用双温点法(93℃变性，65℃左右退火延伸)。
出现片状牵引带或涂抹带。
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。原因往往是酶太多或酶质量差，dNTP浓度太高，Mg2+浓度太高，退火温度太低，循环次数太多。对策是:减少酶的用量，或者换其他来源的酶。②降低dNTP浓度。适当降低Mg2+的浓度。增加模板数量，减少循环次数。