CRISPR-Cas9基因编辑7-测序验证敲除

在通过使用单克隆技术获得多个单克隆细胞系后，有必要验证敲除。除了蛋白质表达水平的检测，测序结果最终取决于它。排序方案也不同。因为之前使用的是CRISPR-Cas9 NHEJ介导的编辑方法，所以通过测量以sgRNA为中心点，长度约500 bp的靶序列，可以查看基因编辑后的基因型。对于模板依赖的HDR介导的CRISPR-Cas9编辑方法，检测方法更复杂。这里需要提到的是，基因编辑并不是刚刚完成。Cas9引起的DNA双股断裂(DSBs)后，DNA修复方式有很多种，细胞修复能力的强弱也决定了基因编辑的效率。这可能是不同单元格编辑效率差的另一个原因。

常规试剂:基因组DNA提取试剂盒，Taq DNA聚合酶(以下简称Taq，有条件可以配备铂？Taq DNA聚合酶高保真)，Q5？高保真DNA聚合酶(以下简称Q5)，凝胶回收试剂盒，TA克隆？试剂盒，带pCR？2.1载体(以下简称T4载体)，感受态细胞。

将单克隆细胞接种到6孔板中，在约80%融合后提取基因组DNA。以基因组DNA为模板，通过Taq PCR实验获得目的基因条带。

因为来自Taq DNA聚合酶P的条带有一个尾巴，它可以连接到T4载体上，所以可以使用任何能使来自Taq DNA聚合酶P的产物有一个尾巴的DNA聚合酶。如果研究组有平端测序载体，可以使用Q5高保真DNA聚合酶。这里需要考虑的是PCR产物能否与后续测序载体匹配。总结如下:

基因组DNA提取后的(1) PCR

由于课题组的限制，我们只有T4测序载体，要求PCR产物要有尾巴。但是我们课题组没有高保真Taq DNA聚合酶，所以我用Q5高保真DNA聚合酶完成了PCR扩增实验，选择了50？l系统，无GC增强剂。

(2)纯化PCR产物

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用凝胶回收试剂盒回收PCR产物。这一步可以按照试剂盒的说明进行。注意凝胶电泳的条带要鲜艳明亮，回收量足够。这部分可以按照产品说明书操作。

PCR产物与目的基因的单侧引物匹配，送样测序。

(2.1)带尾，以便PCR产物能与T载体连接。

建立反应系统

72 ℃孵育20-40分钟(我们这次用40分钟)

(3)将3)的PCR产物与T载体连接后转化入感受态细胞。

以Theromo公司的T4开利为例。

设置反应

室温下孵育5分钟

(4)通过刨削进行克隆扩增。

(5)样本发送和排序

先送PCR产物测序，再根据PCR产物测序结果考虑是否送T载体测序。如果PCR产物测序结果显示有基因改变、嵌套峰等。，它们可以被送到单克隆集落进行测序。

(6)使用Snapgene软件检查测序结果。

打开目标基因序列文件，操作如下。

加载要比较的序列文件，以查看该序列是野生型还是双峰型。

对于NHEJ介导的基因编辑方法，主要依靠碱基的缺失或不等于3的碱基的插入，导致后续阅读中的移码突变，可能引起蛋白质序列或空间构象的变化，蛋白质失去原有功能，从而达到敲除的目的。

如果(1)序列是野生型，基因编辑失败。

(2)如果测序序列为双峰(嵌套峰)，说明是杂合子，可以人工拆解查看基因序列，同时需要送单克隆菌液测序，才能得到测序成品结果；

(3)如果是纯合的，说明同一个碱基被等位基因敲除。当碱基改变的数目是3的倍数时，敲除可能失败，因为它不能引起移码突变。只有改变基数的次数不是3的倍数时，才算成功。如上图所示，一条链缺失一个C碱基，导致后面的读码框发生移码突变，蛋白质未能达到敲除的目的。